Tesis Doctorado en Ciencias Biomédicas

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Variantes genéticas y marcadores de severidad en cáncer de mama: prueba de concepto para la identificación, caracterización y estratificación de riesgo en mujeres del Área Metropolitana de Barranquilla, Atlántico
(Universidad del Norte, 2026) Martínez Olivares, Lilibeth; Vidal Orjuela, Óscar; Vélez Valbuena, Jorge Iván
El cáncer de mama constituye una entidad clínicamente heterogénea, en la cual la severidad clínica al momento del diagnóstico refleja la interacción compleja de factores clínico-epidemiológicos y patológicos. En contextos de ingresos medios, como América Latina, la limitada disponibilidad de información integrada y de enfoques analíticos contextualizados ha dificultado la caracterización sistemática de esta heterogeneidad y el desarrollo de modelos de estratificación de riesgo adaptados a poblaciones locales. En este marco, la presente tesis aborda la necesidad de representar y analizar la severidad clínica basal del cáncer de mama desde una perspectiva multidimensional y metodológicamente rigurosa. El objetivo general fue evaluar factores clínico-epidemiológicos y patológicos asociados a la severidad clínica basal del cáncer de mama, desarrollar modelos de aprendizaje automático con fines exploratorios para estimar la probabilidad de severidad clínica y diseñar una prueba de concepto orientada a la estratificación de riesgo en mujeres del área metropolitana de Barranquilla, Atlántico, estableciendo una ruta metodológica para la futura incorporación de información genómica. Se realizó un estudio observacional analítico de base transversal en una cohorte de 482 mujeres con diagnóstico de cáncer de mama, utilizando información clínica, sociodemográfica, patológica, inmunohistoquímica y terapéutica disponible al momento del diagnóstico. En una primera fase se efectuó una caracterización clínica multidimensional de la cohorte. Posteriormente, se aplicaron métodos de clustering no supervisado para identificar perfiles latentes de severidad clínica basal. En una tercera etapa, se desarrollaron modelos supervisados para estimar de forma probabilística la severidad clínica, entendidos como herramientas predictivas exploratorias y no causales. Finalmente, se diseñó una prueba de concepto metodológica para un modelo integrador y escalable de estratificación de riesgo, concebido para incorporar en fases futuras información genómica y componentes ancestrales, sin generar resultados genéticos en la presente investigación. En conjunto, la tesis evidencia la marcada heterogeneidad clínica y patológica de la cohorte y la factibilidad metodológica de integrar múltiples dominios de información para representar la severidad clínica basal del cáncer de mama. Este trabajo aporta un marco analítico integrador y contextualizado, que sienta las bases metodológicas para el desarrollo futuro de estrategias de estratificación de riesgo adaptadas a poblaciones latinoamericanas y contribuye al fortalecimiento de la investigación traslacional en oncología.
Participación de la vía de señalización MEK-ERK1/2 en el ciclo de replicación del virus sincitial respiratorio en cultivos primarios de epitelio bronquial humano (NHBE)
(Universidad del Norte, 2023) Ávila Arias, Marcio Andrés de; San Juan Vergara, Homero
El Virus Sincitial Respiratorio (VSR) es una amenaza grave, causando infecciones respiratorias severas en niños. Aunque se han hecho avances, los detalles sobre cómo infecta células y modula señales celulares siguen siendo misterios. Sorprendentemente, aún no existe terapia ni vacuna específica para este virus. Este estudio se enfocó en la vía de señalización MEK1/2-ERK1/2 y su función en la infección por VSR. Utilizando células de epitelio bronquial humano y un VSR modificado genéticamente, se observó una activación constante de la proteína ERK-1/2 durante hasta 20 horas después de la infección, un proceso esencial en la infección. La inhibición de la vía MEK-ERK1/2 con compuestos específicos mostró efectos notables. Un inhibidor, Ulixertinib, redujo la entrada viral en un 60% a 25 μM y en un 33% a 12.5 μM. Además, estos inhibidores afectaron la producción de ARN viral, sin influir en la replicación genómica. Destaca el impacto en la proteína P del VSR, que mostró alteraciones desde las 8 horas después de la infección, sugiriendo un posible vínculo con la transcripción viral. En resumen, el estudio arrojó luz sobre la dinámica temporal de la activación de ERK-1/2 durante la infección por VSR, confirmando su relevancia en la entrada viral. También se descubrió que la vía MEK-ERK1/2 influye en la transcripción viral, lo que podría abrir nuevas perspectivas para abordar la infección sin terapias específicas hasta ahora.
El virus sincitial respiratorio (VSR) no requiere endocitosis para infectar células de epitelio bronquial humano normal (NHBE)
(Universidad del Norte, 2022) Cadena Cruz, Christian Camilo; San Juan Vergara, Homero
El virus sincitial respiratorio (VSR) es la causa más frecuente de bronquiolitis en menores de 2 años. Actualmente no hay vacunas disponibles para prevenir la infección. La infección por VSR se inicia mediante la fusión entre la membrana del virión y la liberación del genoma al citoplasma, lugar donde se llevará a cabo la transcripción y replicación. En la actualidad no está claro si el proceso de fusión tiene lugar en la membrana plasmática o dentro del endosoma. En este trabajo se compararon dos temperaturas de sincronización (4 °C y 22 °C) para determinar la cinética de entrada del VSR en las células epiteliales bronquiales humanas. Posterior a la inoculación, la entrada del virus fue bloqueada en diferentes momentos mediante la adición de un anticuerpo neutralizante o mediante una disminución de la temperatura a 4 °C. Además, se diseñó un virus que porta un gen viral adicional, el cual consta la beta-lactamasa fusionada con la fosfoproteína viral (P), la cual codifica una proteína quimérica que permite una detección rápida una vez que el virus deposita su contenido en el citoplasma. Los hallazgos mostraron que la temperatura de sincronización utilizada durante la inoculación determina el sitio de fusión. Una transición de 4 °C a 37 °C dio como resultado la entrada del VSR a través de la vía endosomal, pero también indujo la alteración de la actina F y la formación de “blebbing” en la membrana plasmática, independientemente si fueron o no infectadas por el virus. Una transición de 22 °C a 37 °C demostró que la entrada del VSR se da por la vía de fusión en la membrana plasmática y se confirmó que dicha transición no presenta formación de estructuras en la membrana ni la alteración del citoesqueleto de actina. Para determinar la contribución de la endocitosis en la infección por VSR, se evaluó el efecto de moléculas pequeñas que bloquean la endocitosis, previo y posterior a la adsorción de viriones, confirmando qué, al aplicar dichos compuestos posterior a la adsorción viral, el bloqueo de rutas endocíticas no afecta la infección. Estos resultados sugieren que el VSR normalmente ingresa a las células por fusión en la membrana plasmática y que la inducción de endocitosis por la sincronización de la infección a 4 °C puede ser considerado como un artefacto del modelo experimental causado por la distorsión del citoesqueleto que soporta la membrana plasmática.
Evaluación de biomarcadores inmunogenéticos determinantes de la respuesta inmunológica del huésped, microambiente y progresión tumoral en carcinoma invasivo de la mama de endofenotipo Triple Negativo.
(Universidad del Norte, 2024) Barrios Barreto, Rina Paola; Silvera Redondo, Carlos; Garavito Galofre, María del Pilar
El cáncer de mama es el tumor maligno más común en la población femenina, con altas tasas de mortalidad a nivel mundial y local. Por tal razón, el grupo internacional de biomarcadores oncológicos ha estudiado la importancia de cuantificar la respuesta inmunitaria linfocitaria adaptativa en pacientes que padecen esta enfermedad con el fin de determinar factores pronósticos y definir conductas de tratamiento. A partir de esta realidad, se trazó el objetivo de caracterizar la respuesta inmunitaria del huésped, expresión de genes asociados en la carcinogénesis de neoplasias malignas invasivas de la mama en la población de estudio, con el fin de identificar biomarcadores inmunológicos y genéticos que sean susceptibles de desarrollar terapias diana. La metodología de este estudio se realizó dentro del marco de la patología molecular y de medicina básica aplicada, por lo cual se planteó una investigación observacional analítica, siendo la población objeto de estudio pacientes de sexo femenino con diagnóstico de carcinoma invasivo de la mama de endofenotipo triple negativo que tengan confirmación por estudios histopatológicos en laboratorio de patología de referencia en oncología de la región caribe colombiana, excluyendo a las pacientes con diagnóstico clínico presuntivo de cáncer sin confirmación histológica y tratamiento con agentes quimioterapéuticos. Para el análisis de los datos se realizaron tablas y gráficos de frecuencia donde se relacionaron las variables cualitativas y cuantitativas como fueron la edad, tipo histológico de cáncer, perfil biológico por inmunohistoquímica, porcentaje de infiltración linfocitaria tumoral estromal, expresión de PD-L1 en células tumorales y linfocitarias, expresión de factores de transcripción p-STAT-3 y p-STAT-1 en las células neoplásicas infiltrativas. Con ello se identificaron las características inmunológicas, adaptativas y genéticas determinantes de mecanismos de carcinogénesis en pacientes con carcinoma infiltrativo de la mama de endofenotipo triple negativo, permitiendo conocer rutas metabólicas y proponer biomarcadores predictivos innovadores en el contexto de la medicina de precisión.
Evaluation and validation of a point-of-care type biosensor for the measurement of S100B in plasma as a potential predictor of neurological impairment in traumatic brain injury
(Universidad del Norte, 2021) Rodríguez Sanjuán, Alexander; Villalba Amarís, Pedro Javier; San Juan Vergara, Homero
Traumatic brain injury (TBI) represents at least half of the trauma-related deaths, with a reported mortality rate of 37% in severe TBI. It is considered one of the significant causes of disability globally, producing high annual costs to the healthcare system. A crucial aspect in managing these patients is to predict their evolution immediately after the trauma, which allows an adequate classification of the TBI severity before the appearance of clinical or imaging indicators. The above has stimulated the search for other early indicators of brain injury, such as plasma biomarkers, among which the S100B protein, released from damaged nerve cells into the bloodstream, is one of the most extensively studied, with solid evidence reported associating its blood levels with the probability of intracranial injuries. Currently, the standard tests for S100B detection require either immunoassay or other complex/expensive laboratory techniques, which are also not available in primary trauma care areas, requiring prior sample processing. The little availability of cost-effective, easy-to-use, and rapid methods for the timely measurement of S100B justify the development of a point-of-care device to detect and quantify this biomarker. This work aims to fill this gap, focusing on the manufacture, evaluation, and validation of an electrochemical biosensor for the label-free detection of S100B in plasma. Disposable electrodes based on low-cost materials were used to manufacture two different platforms of detection: DropSens carbon-polyaniline and thin gold film three-contact electrodes. The first biosensor, based on the C-Pani, was fabricated using the covalent binding of the antibody to cysteamine-single assembled monolayer via EDC-NHS cross-linking. This biosensor was able to identify the S100B biomarker in spiked plasma through impedance measurements with a limit of detection of 34.13pg/ml in a range of 10-316pg/ml. In addition, a +0.2V DC set potential instead of open circuit potential (OCP) before the EIS runs was proposed as a novel strategy to counteract the undesirable effects on the electrical properties of pH on the Pani protonation and conductivity. The second developed biosensor used the same chemistry of functionalization, this time onto Au electrodes. The Au/Cys/anti-S100B biosensor showed selectivity to identify S100B in plasma in the 10pg-316pg/ml clinically relevant range and a limit of detection of 18pg/ml. Better overall results were obtained when a strategy based on Au electrodes instead C-Pani electrodes was implemented to construct the biosensor, supporting this approach as a promising strategy for the manufacture of an S100B-point-of-care-type biosensor. Furthermore, this strategy also could be a valuable framework for designing immunosensors for other biomarkers. Further studies are necessary to assess the developed biosensor using samples from multiple individuals, compared to the gold standard technique in clinical trials to evaluate the sensibility and specificity of the medical device and to identify nuisance factors affecting the measurement, such as temperature, humidity, electrical noise in real settings beyond the laboratory Future works are proposed to evaluate a point-of-care device in a predictive model that integrates S100B tests to clinical/tomographic data to support initial TBI classification, prognosis, and follow-up, becoming a guide for the therapeutic level of intensity.
Análisis genómico y caracterización de la virulencia de Leptospira spp: aisladas de pacientes humanos en el Área Metropolitana de Barranquilla
(Universidad del Norte, 2024) Cuello Pérez, Margarett; Romero Vivas, Claudia; Falconar, Andrew K. I.
La bacteria Leptospira spp. patógena causa leptospirosis humana y animal letal. Se considera endémica en las regiones tropicales y subtropicales, cuyos síntomas se solapan con los de otras enfermedades como dengue (DF) y sus formas más graves ("dengue grave"), causadas por los virus del dengue (DENV), transmitidos por mosquitos urbanos. En este proyecto se quiso evaluar si la presentación clínica de algunos casos de leptospirosis humana, incluida una muerte, se debió a coinfecciones por Leptospira spp. y DENV o a una especie/cepa de Leptospira spp., particularmente virulenta; mediante la determinación de la secuencia genómica y el análisis de posibles "marcadores de virulencia". En este estudio, se realizó una amplia gama de ensayos de diagnóstico diferencial de Leptospira spp. y DENV y se determinaron las secuencias genómicas completas de Leptospira spp. para identificar sus serovares, así como las posibles variaciones de las cepas y los genes o mutaciones genéticas que podrían explicar su mayor patogenicidad o resistencia a los antimicrobianos, lo que también se comprobó utilizando el modelo animal Misocricetus auratus (hámster dorado). Algunos pacientes con infecciones por DENV en curso, generaron reacciones falsas positivas en la prueba de microaglutinación microscópica (MAT) anti-Leptospira spp. "prueba de oro" avalada por la Organización Mundial de la Salud, por lo cual se recomendó el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica del gen lipL32 de Leptospira spp., para identificar los falsos casos coinfectados por DENV/ Leptospira spp., suministrar al paciente la terapia adecuada y evitar "dengue grave", potencialmente mortal.
Explorando la vía de entrada del virus sincitial respiratorio (VSR) en un modelo de epitelio mucociliar bien diferenciado
(Universidad del Norte, 2023) Hurtado Gómez, Leidy Vanessa; San Juan Vergara, Homero
El Virus Sincitial Respiratorio (VSR) es el patógeno viral causante de infecciones severas en las vías aéreas inferiores, tales como: neumonía y bronquiolitis. Afecta con mayor severidad a neonatos en los primeros meses de vida, a niños prematuros y menores de 5 años, ancianos y pacientes inmunosuprimidos. Se considera que la infección por VSR es la segunda causa de muerte en niños menores de un año en el mundo. No es claro el mecanismo de entrada que emplea para infectar su blanco, el epitelio bronquial humano. Se generó un epitelio bronquial respiratorio en condiciones de interfase aire líquido (ALI) bajo condiciones de reprogramación condicionada (RC), lo cual permitió simular las condiciones reales en las que se da la infección por VSR. Se evaluó el tropismo del VSR en relación con 3 tipos de células (basales, productoras de moco y ciliadas) en las diferentes semanas de maduración del epitelio bronquial humano (1 a 4 semanas), observándose infección en todos los tipos de células, mayoritariamente en las ciliadas a lo largo de las 4 semanas. Los inhibidores de actina, dineína y transporte intraflagelar tuvieron efecto en la entrada, pero no en eventos post infección del VSR, demostrando que la modulación y la dinámica de actina es necesaria para la entrada e infección del VSR. Se logró determinar viriones infecciosos al interior de las células a través de la etiqueta sulfo-NHS-SS-Biotin de la envoltura, dicha señal se asoció con flotilina, caveolina y clatrina, proteínas involucradas en endocitosis.
Diseño in silico de una proteína multi-epítopes y evaluación de sus propiedades inmunogénicas e hipoalergénicas
(Universidad del Norte, 2023) Fang Mercado, Luis Carlos; Egea Bermejo, Eduardo; Garavito de Egea, Gloria; Martínez de la Ossa, Dalgys
Las enfermedades alérgicas se caracterizan por tener una alta prevalencia a nivel mundial. La inmunoterapia alérgeno-específica es capaz de modificar la inflamación alérgica. La cisteína proteasa, la glutatión S transferasa y la tropomiosina de los ácaros del polvo doméstico – APD - (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Blomia tropicalis) y Ascaris lumbricoides son los principales agentes implicados en la sensibilización alérgica en poblaciones del trópico. En la presente tesis se diseñó, expresó y caracterizó una proteína multi-epítopes (MP-001) basada en epítopes de células T de Ascaris lumbricoides y APD. MP-001 se produjo en E coli. La reactividad de IgE se evaluó mediante Dot-blot y ELISA en el suero de individuos alérgicos. Se evaluó la prueba de activación de basófilos, el porcentaje de proliferación de linfocitos T CD3+ y CD4+ y las poblaciones Treg (CD4+, CD25+ y FoxP3) mediante citometría de flujo en monocitos de sangre periférica (PBMC) de pacientes con asma alérgica sensibilizados a APD. MP-001 mostró una reactividad de IgE significativamente menor que el extracto de D. pteronyssinus. MP-001 indujo una menor activación de basófilos que el extracto de alérgeno. MP-001 indujo la proliferación de células T CD3+ CD4+ específicas y aumentó el porcentaje de células Treg en cultivos de PBMC. Estos resultados sugieren que MP-001 tiene propiedades inmunológicas con uso potencial en la modulación de enfermedades alérgicas asociadas a APD.
ARN no codificantes largos exosomales y su papel en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer
(Universidad del Norte, 2023) Mosquera Heredia, María Isabel; Garavito Galofre, María del Pilar; Vélez, Jorge I.
Los exosomas son nanovesículas extracelulares de origen endocítico, con forma esférica, delimitada por una membrana lipídica, y diámetro promedio de 30-150 nm. Se sabe que los exosomas contienen varias moléculas bioactivas, incluyendo proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y metabolitos. Es así como su relevancia funcional, radica en el efecto que estas vesículas tienen al entregar su contenido a las células receptoras, participando tanto en procesos fisiológicos, como la proliferación celular, la respuesta inmune, la lactancia y la función neuronal y cardiovascular; como en procesos patológicos, contribuyendo a la génesis de distintas enfermedades. El ácido ribonucleico (RNA, por su sigla en inglés) se considera el principal componente funcional del exosoma. Se ha demostrado que la carga de RNA refleja el estado y el contenido citoplasmático de la célula de origen, y una vez en la célula receptora, esta molécula desempeña el mismo papel que en la célula de origen, regulando genes diana que podrían estar involucrados en la patogénesis de las enfermedades. En el caso de la Enfermedad de Alzheimer (EA), principal tipo de demencia en el mundo representando el 60 – 70% de los casos, la investigación en este campo apenas inicia, por lo tanto, falta aún identificar nuevos RNA no codificantes (ncRNA) involucrados y aclarar cómo participan en las vías patogénicas de la enfermedad; esta información permitiría establecerlos como futuros biomarcadores o blancos terapéuticos de la EA. Este trabajo tiene como objetivo caracterizar el perfil de expresión diferencial de RNA no codificantes largos (lncRNA, por su sigla en inglés) en exosomas sanguíneos y su asociación con la patogénesis de la EA de inicio tardío. Para ello, se diseñó un estudio de casos y controles, conformándose 2 grupos con 15 sujetos cada uno: casos de EA esporádica y un grupo control. La muestra de casos se reclutó a partir de una población que asiste al Instituto Colombiano de Neuropedagogía de Barranquilla, conformada por sujetos con diagnóstico de esta enfermedad, y los participantes del grupo control son voluntarios no familiares con edades entre 72 - 106 años. Para la obtención de datos se identificaron los lncRNA contenidos en exosomas sanguíneos y se caracterizó su perfil de expresión diferencial en los casos y controles mediante estudio de microarreglos. Posteriormente, se analizó la asociación con sus posibles genes diana mediante un estudio in silico, con el fin de dar una aproximación de su papel en la red patogénica de la EA. Finalmente, se correlacionaron las variables neuropsicológicas y la edad de inicio de la enfermedad con los niveles de expresión de los lncRNA identificados y se logró establecer con esta información un modelo predictivo de la enfermedad basado en Machine Learning (ML). Se encontró un total de 647 lncRNA expresados diferencialmente entre los grupos. De estos, 550 estuvieron sobreexpresados y 97 subexpresados. Entre ellos, se identificaron varios lncRNA como TMEM186, PROX1-AS1, AC109635.2, LINC02043, AC022031.2, POT1-AS1, AL020993.1, ERICH3, DEXI, SS18, AC073529.1, TAB2-AS1, AC117382.2, AC007342.1, HTR2A-AS1, LINC01232, SOX9-AS1 y PCA3, que podrían estar involucrados en la patogénesis de la enfermedad, afectando procesos clave como la neurogénesis, diferenciación celular, proteostasis del péptido Aβ y p-TAU. Neuroinflamación, apoptosis, crecimiento de la neurita, plasticidad sináptica y remodelación de la cromatina. Todos estos lncRNA se correlacionan mínimo con dos de las variables neuropsicológicas evaluadas, siendo la flexibilidad cognitiva el dominio con mayor número de lncRNA asociados (16/18); solo ERICH3 y AC007342,1 no mostraron correlación. Por su parte, los lncRNA AC117382.2 y LINC01232 se asociaron con la edad de inicio de la enfermedad. Entre los algoritmos de ML explorados, se pudo establecer que el algoritmo svmLinear2 fue el de mejor rendimiento con una precisión del 99%. El análisis de importancia reveló que los mejores predictores de la enfermedad eran PROX1-AS1 y SS18. Se espera que el aporte generado en este estudio relacionado con la comprensión de la fisiopatología molecular de la EA y el diseño del modelo predictivo pueda ser útil en el ámbito clínico para anticipar el desarrollo de la enfermedad, gracias a lo cual se podrán ofrecer alternativas preventivas que retrasen la aparición y/o progresión de la EA en los sujetos afectados, mejorando su calidad de vida y la de sus cuidadores.
Variantes genéticas asociadas al trastorno por déficit de atención e hiperactividad en una comunidad del Caribe colombiano
(Universidad del Norte, 2022) Cervantes Henríquez, Martha Lucía de los Milagros; Vélez Valbuena, Jorge Iván; Puentes Rozo, Pedro
El trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH) es un rasgo genético complejo con un fenotipo heterogéneo conducente a alteraciones cognitivas-comportamentales; comórbido con trastornos internalizantes y externalizantes. Las variantes genéticas en genes ADGRL3, NCAM1, DRD2, DRD4, TTC12 y ANKK1 están asociadas con la etiología de TDAH. Se identificó variantes genéticas que confieren asociación al TDAH y su correlación con endofenotipos cognitivos en familias nucleares del área metropolitana de Barranquilla, quienes presentan una hetero-etnicidad. Particularmente, se establecieron características clínicas como candidatas a endofenotipos del TDAH en familias; Desarrollo e implementacion un modelo de predicción para diagnosticar TDAH a partir de variables demográficas, clínicas y variantes genéticas; se establecieron perfiles de severidad y su asociación con variantes genéticas en el TDAH; y se identificaron variantes genéticas relacionadas a endofenotipos cognitivos utilizando análisis de asociación. Nuestros hallazgos apoyan la heterogeneidad y complejidad del TDAH, en una comunidad caracterizada por una mezcla racial con ascendencia predominantemente africana. específicamente, se encontraron endofenotipos cognitivos relacionados con dominios de memoria de trabajo y organización perceptual que constituye una nueva visión explicativa del TDAH y serán útiles para precisar la base neurobiológica y genética del TDAH. Además, se identificaron variantes genéticas en los genes ADGRL3, SNAP-25 y DRD4 asociadas con estos endofenotipos cognitivos y la severidad del TDAH en esta población, y se desarrolló, validó e implementó un modelo predictivo para el diagnóstico del cuadro clínico. Esta aproximación ofrece una oportunidad para aplicación de estrategias en medicina traslacional y genómica que podrían facilitar la evaluación del TDAH.

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